Featured Application: Force C18を用いたメチルマロン酸(MMA)分析

LC-MS/MSによるヒト血しょう中の非誘導体化メチルマロン酸分析

  • 正確な結果をもたらす異性体のベースライン分離。
  • シンプルなタンパク質変性法による前処理。誘導体化の必要はありません。
  • ハイスループットラボ向けの高速分析。

ビタミンB12は代謝エネルギー生産に不可欠な役割を果たしており、その欠乏症は様々な症状を呈するため、検査をせずに診断するのは困難です。血しょうサンプルの臨床検査では、高レベルのメチルマロン酸(MMA)によるビタミンB12欠乏症や先天性代謝異常であるメチルマロン酸血症の診断が可能です。メチルマロン酸測定は非常にセンシティブな試験で、ホモシステイン検査よりも特異的です。通常、メチルマロン酸測定には、液-液抽出、誘導体化、溶媒乾固さらにSPEを使用する複雑な試料前処理が必要となります。さらに、メチルマロン酸と天然に存在するその異性体であるコハク酸とのクロマトグラフィー分離を達成するのは困難です。

このような障害を克服するため、Restekではメチルマロン酸の簡便な分析法を開発しました。ここに示したアプローチでは、タンパク質変性によりサンプルを処理し、誘導体化は必要としません。誘導体化をなくすことでかなりの時間とリソースが節約でき、さらに測定値の変動要因を排除することにもなります。分析には、上清を直接Force C18カラムへ導入します。LC-MS/MSによる分析結果は、メチルマロン酸がコハク酸から明らかに分離し、潜在的なアイソバリック干渉が排除され、ピークの同定と定量が容易であることを示しています。さらに、分析時間は5分となっており、この方法はビタミンB12欠乏症およびメチルマロン酸血症の臨床検査のためのハイスループット分析に適していると言えます。


PeakstR (min)Precursor IonProduct Ion
1.Succinic acid1.68117.373.1
2.Methyl-D3-malonic acid2.02120.276.2
3.Methylmalonic acid2.03117.373.1
Methylmalonic Acid in Human Plasma on Force C18 by LC-MS/MS
LC_CF0718
ColumnForce C18 (cat.# 963431E)
Dimensions:100 mm x 3.0 mm ID
Particle Size:3 µm
Pore Size:100 Å
Guard Column:Force C18 EXP guard column cartridge 3 mm ID, (cat.# 963450253)
Temp.:35 °C
Sample
Conc.: 13 ng/mL Methylmalonic acid (endogenous) in double charcoal stripped human plasma
Inj. Vol.:3 µL
Mobile Phase
A:0.5% Formic acid in water
B:0.5% Formic acid in methanol
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.7955
0.500.7955
3.000.7595
3.010.7955
5.000.7955
DetectorMS/MS
Ion Mode:ESI-
Mode:MRM
InstrumentHPLC
Notes100 μL of sample (double charcoal stripped human plasma containing 13 ng/mL of endogenous methylmalonic acid) was aliquoted for extraction. 5 μL of internal standard (2,500 ng/mL MMA-D3 in water) was added to the sample. The sample was precipitated using 300 μL of 0.5% formic acid in methanol followed by a 10 second vortex at 3,000 rpm. The sample was then centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes at 10 °C. 250 μL of the supernatant was filtered using a Thomson SINGLE StEP standard filter vial (PVDF, 0.2 μm, Restek cat.# 25895) prior to analysis.

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