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Featured Application: Raptor HILIC-Siを用いた血しょう中葉酸欠乏症バイオマーカー分析

LC-MS/MSによる迅速かつ正確な血しょう中の葉酸欠乏症バイオマーカー分析

  • Raptor HILI-Siカラムによる強い保持力でマトリックスの影響を防止
  • リン脂質との完全分離により、分析時間5分での正確な結果
  • マトリックスを系外へ排出できるためMSイオンソースが汚れにくく、メンテナンスによるダウンタイムは低減

葉酸欠乏は、新生児の神経管欠損、心血管疾患、アルツハイマー病やある種のがんといった幅広いヒトの健康問題の危険因子であると考えられ ています。葉酸およびその代謝産物(5- ホルミルテトラヒドロ葉酸と5- メチルテトラヒドロ葉酸) の血しょう中濃度は、葉酸欠乏症診断用のバ イオマーカーとして使用されています。しかし、このような小さな極性化合物は通常の逆相モードでは保持が弱く、LC-MS/MS による血しょう 中の葉酸欠乏バイオマーカー分析は困難です。保持はHILIC モードにより改善できますが、その場合でも、カラムは血しょうマトリックスであ るリン脂質成分との共溶出を防げるだけの保持力が必要となります。優れたサンプル前処理法によって防ぐことはできますが、リン脂質を100 %除去することは非常に難しい上に、低濃度のリン脂質であっても目的化合物の妨害となり、定量性を悪くし、MS イオン源の汚染につながる 可能性があります。

分析時間が短く、マトリックスと目的化合物を完全に分離できるため、血しょう中の葉酸欠乏症バイオマーカー分析には、Raptor HILIC-Siカ ラムによるLC-MS/MS分析が適しています。Raptor HILIC-Siカラムによる保持力の向上は、リン脂質とバイオマーカーを十分に分離します。こ のためわずか25~50 ng/mLの目的化合物でさえ、マトリックスによるイオン化抑制を受けずに精確に定量することができます。さらに、分析 種とマトリックス成分が十分に分離しているため、マトリックスを系外へ排出することでMSが汚れるのを防ぐこともできます。ここで示した LC-MS/MSによる血しょう中の葉酸欠乏のバイオマーカー分析では、葉酸、5-ホルミルテトラヒドロ葉酸および5-メチルテトラヒドロ葉酸をマ トリックスの影響なく5 分で分析できます。


PeakstR (min)Conc.
(ng/mL)
Precursor IonProduct Ion
1.5-Formyl tetrahydrofolate2.2350474.2327.0
2.Folic acid2.2325442.2295.0
3.5-Methyltetrahydrofolic acid2.2525460.3313.0
Folate Deficiency Biomarkers in Human Plasma on Raptor HILIC-Si by LC-MS/MS
LC_CF0698
ColumnRaptor HILIC-Si (cat.# 9310A5E)
Dimensions:50 mm x 3.0 mm ID
Particle Size:2.7 µm
Temp.:30 °C
Sample
Diluent:20 mM Ammonium acetate in acetonitrile:water (80:20) containing 10 mg/mL 2-mercaptoethanol
Inj. Vol.:5 µL
Mobile Phase
A:50:50 Water:acetonitrile, 20 mM ammonium acetate
B:20:80 Water:acetonitrile, 20 mM ammonium acetate
Time (min)Flow (mL/min)%B
0.000.5100
3.000.50
3.200.50
3.210.5100
5.210.5100
Max Pressure:344 bar
DetectorMS/MS
Ion Mode:ESI+
Mode:MRM
InstrumentUHPLC
NotesSample Preparation Method:
1. Aliquot 380 μL of human plasma (K2EDTA, 2x charcoal stripped) containing 100 μg/mL 2-mercaptoethanol and add 20 μL fortification solution.
2. Vortex for 2 min and centrifuge for 2 min at 4,000 rpm.
3. Condition EVOLUTE EXPRESS WAX 30 mg SPE plate (Biotage 604-0030-PX01) with 1 mL methanol and then equilibrate with 1 mL 2% formic acid in water. Apply vacuum to dry the plate completely.
4. Load 400 μL of sample onto the plate and apply vacuum to initiate the flow.
5. Wash the plate with 1 mL water. Apply vacuum to dry the plate completely.
6. Elute samples with 300 μL 5% ammonium hydroxide in methanol containing 10 mg/mL 2-mercaptoethanol. Apply vacuum for elution.
7. Evaporate extracts to dryness under nitrogen at 30 °C.
8. Reconstitute in 200 μL mobile phase B containing 10 mg/mL 2-mercaptoethanol.

Note: The whole sample preparation process was performed under dim light.

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